ABSTRACT
Sexual differences in size and morphology are common in the animal kingdom and they have been mainly explained by sexual selection. According to classic theory of sexual determination and differentiation, the morphologic differences between the same specie individuals both different sex starts to show up soon after and as a consequence of the gonads formation and development. However, increasing evidence coincide in signaling that differences between males and females star to be evident long before of gonads formation, from preimplantatory stadium [week 1] or even from zygotic stadium [day 1]. Differences in kinetics of development and in energetic preimplantatory metabolism have been explained by genetic and epigenetic differences which underlie it and, in the case of get persistent, they can take them until disrupting the normal sex ratio. In this review about sexual dimorphism in preimplantatory embryos hypothesis, accumulated evidences and scenarios [in vivo e in vitro] are explored, as well as the last findings and possible changes that will have to be faced by the embryology.
Las diferencias sexuales en tamaño y morfología son comunes en el reino animal y se han explicado principalmente por la selección sexual. De acuerdo con la teoría clásica de la determinación y diferenciación sexual, las diferencias morfológicas entre individuos de la misma especie pero de diferente sexo se empiezan a manifestar poco después ycomo consecuencia de la formación y desarrollo de las gónadas. No obstante, evidencia creciente coincide en señalarque las diferencias entre machos y hembras se comienzan a manifestar mucho antes de la formación de las gónadas, desde el estado preimplantatorio [semana 1] e inclusive desde el estado cigótico [día 1]. Diferencias en la cinética dedesarrollo y en el metabolismo energético preimplantatorio han sido explicadas por diferencias genéticas y epigenéticas que les subyacen y que de persistir pueden llegar hasta afectar la normal proporción de los sexos. En la presente revisión sobre el dimorfismo sexual de embriones preimplantatorios se exploran las hipótesis, las evidencias acumuladas, los escenarios [in vivo e in vitro] y, a la luz de los últimos hallazgos, los posibles cambios que deberá enfrentar la embriología.
As diferenças sexuais no tamanho e morfologia são comuns no reino animal e foi explicado principalmente pelaseleção sexual. De acordo com a teoria clássica da determinação e diferencia sexual, as diferencias morfológicasentre indivíduos da mesma espécie, porém de diferente sexo começam a manifestar pouco depois e comoconsequência da formação e desenvolvimento das gônadas. Contudo, evidencia crescente coincide em assinalar que as diferenças entre machos e fêmeas começam a se manifestar muito antes da formação das gônadas, desde o estadopreimplantatorio [semana 1] e inclusive desde o estado cigótico [dia 1]. Diferenças na cinética de desenvolvimento e no metabolismo energético preimplantatorio foram explicadas por diferenças genéticas e epigenêticas que lhes segueme que de persistir podem chegar até em afetar a normal proporção dos sexos. Na presente revisão sobre o dimorfismosexual de embriões preimplantatorios são exploradas as seguintes hipóteses, as evidencias acumuladas, os cenários[in vivo e in vitro] e, à luz dos últimos descobrimentos, as possíveis mudanças que deverá enfrentar a embriologia.
Subject(s)
Animals , Body Patterning , Embryo Research , Embryonic Development , Fertilization , Fertilization in Vitro/veterinary , Reproduction , Reproduction/genetics , Sex Characteristics , Fertilization in Vitro/ethics , Genetics/ethics , Genetics/instrumentation , Hormones/genetics , Embryo Research/ethicsABSTRACT
El objetivo de este estudio fue evaluar un nuevo procedimiento de fertilización in vitro (FIV) de ovocitos bovinos, en el cual se omitió la centrifugación de los espermatozoides para los procesos de lavado y selección espermática. Dentro de cada uno de los pozos de los platos convencionales de cuatro pozos (pozos externos) se introdujo un nuevo pozo más pequeño (pozos internos) de aproximadamente 50 μl hecho en material de vidrio (0.3 mm de alto por 0.8 mm de diámetro). El procedimiento consistió en llenar los pozos interno y externo con 700 μl de medio de fertilización, hasta que el pozo interno quedara cubierto de medio, luego se depositaron 10 CCOs por pozo interno; luego 30 μl de semen previamente descongelado se depositaron en el fondo del pozo externo. Después de una hora se removió todo el contenido del pozo externo y se dejó el contenido del pozo interno con el medio y las células germinales por un periodo de incubación de 16 h. Los presuntos cigotos fueron cultivados en medio CR1aa por un periodo de siete días con un cambio de medio a las 72h. Como control, se utilizó un gradiente de Percoll 45-90% para la selección espermática. La tasa de de ovocitos divididos fue de (70.8 vs. 73.1) y la proporción de ovocitos que llegaron al estadio de morúla y blastocisto fue de (18.8 vs. 20.3), respectivamente. Los resultados obtenidos con la nueva propuesta metodológica son similares a los obtenidos con la metodología convencional (p<0.05). Estos resultados indican que ambos métodos producen resultados similares pero la nueva propuesta metodológica permite ahorrar tiempo, es menos laboriosa, consume menos reactivos y permite reducir la manipulación de las células espermáticas con buenos efectos eventuales en el mejoramiento de los procedimientos de reproducción in vitro.
This study was conducted to evaluate an in vitro fertilization (IVF) procedure that avoids the washing-selection-centrifugation of spermatozoa prior to coincubation with oocytes. A special dish was constructed as follows: in the middle of each of the 4-wells of a conventional plastic dish (larger wells), another little (≈50 μl) glass dish (inner well) was placed (0.3 mm-tall x 0.8 mm in diameter), in such a way that when the larger plate was filled with 700 μl of IVF media (FertTALP), the inner well was also filled up to overflowing. Ten in vitro matured oocytes were set into the inner well, and 30 μl of thawed semen were placed on the bottom of the outer well. After one hour of incubation, the media from the outer well was removed, and the well with the remaining media and the germ cells, were incubated for 16 hours. Presumptive zygotes were cultured in a CR1aa media for seven days with a culture media replace at 72 h. As a control, a conventional IVF, using the classical 45%-90% Percoll gradient selection, was carried out. The cleavage rates (70.8 vs. 73.1) and the proportion of oocytes reaching morula and blastocyst stages (18.8 vs. 20.3) by the easy-IVF were similar to the results obtained by the classical method (p<0.05). These results indicate that the two methods yield similar results but the easy-IVF definitely saves time, human effort, reagents, and after all reduces the manipulation of the sperm with eventual good effects in the long run toward improving in vitro reproduction procedures.
O objetivo deste estudo foi avaliar um novo procedimento de fertilização in vitro (FIV) de oócitos bovinos, que foi omitida na centrífuga esperma lavar os processos de seleção e de esperma. Dentro de cada um dos poços pratos convencionais quatro poços (poços externa) um novo bem menor (poços internos) cerca de 50 μl fato em vidro (0,3 mm de altura por 0,8 mm de diâmetro) foram introduziu. O procedimento foi de encher poços interna e externamente com 700 μ l meio de fertilização, até que a fossa foi coberto por meios internos e, em seguida, depositadas 10 CCOs em poços internos; então 30 μl previamente descongelados sêmen foi depositado no fundo da cova fora. Depois de uma hora é retirada a todo o conteúdo da cova, e foi deixada fora da doméstica no conteúdo do bem com o ambiente e células germinativas por um período de incubação de 16 h. A alegada zygotes foram cultivados em meio CR1aa por um período de 7 dias com uma mudança no meio-72h. Como um controle, utilizado uma gradiente de Percoll 45-90% de selecção de espermatozóides. A taxa de oócitos foi dividida (70.8 vs 73.1) e da proporção de oócitos que atingiu o estádio e foi Mórula blastocisto (18.8 vs 20.3), respectivamente. Os resultados obtidos com a nova metodologia proposta são semelhantes aos obtidos com a metodologia convencional (p<0.05). Estes resultados indicam que ambos os métodos produzem resultados semelhantes, mas a nova proposta metodológica economiza tempo, é menos trabalhoso, consome menos reativo e reduzem a manipulação de células espermáticas com bons potenciais efeitos na melhoria dos procedimentos reprodução in vitro.
Subject(s)
Cattle , Animals , Embryo Research , Fertilization in Vitro , In Vitro Techniques , Oocytes , SpermatozoaABSTRACT
La glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), codificada por un gen ubicado en el cromosoma X, es la enzima limitante de vía de las pentosas fosfato (PF). La entrada de la glucosa así como su flujo y el rendimiento metabólico de esta vía están determinados tanto por los mismos niveles glucosa así como por la actividad de la G6PD. Por esta vía, la glucosa regula la trascripción de varios genes lipogénicos. En algunos embriones hembra producidos in vitro, se registra un retardo en la normal inactivación de uno de sus cromosomas X, lo cual se traduce en una doble actividad de los genes allí ubicados, si se compara con los embriones macho producidos in vitro. Se postula entonces que, la sobre-regulación de la vía PF a consecuencia de la doble dosis de su enzima limitante (G6PD) y en presencia de elevados niveles de glucosa (mayores a 2,5 mM en el medio de cultivo), conllevaría a un dimorfismo sexual en relación con la transcripción de los genes Acetil CoA Carboxilasa Alfa (en adelante ACACA, símbolo oficial de la acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha), y la Sintetasa de Ácidos Grasos (en edelante FASN, símbolo oficial de la fatty acid synthase) que corriente abajo codifican para las enzimas limitantes en la síntesis de lípidos. Este dimorfismo sexual para el fenotipo metabolismo de lípidos, derivaría en una mayor acumulación citoplasmática de gotas lipídicas en los embriones hembra en comparación con los embriones machos que, de ser así, tendría efectos expansivos sobre el metabolismo general, la actividad transcripcional de otros genes y sobre la resistencia a la criopreservación.
The encoding gene for glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is located on chromosome X. This enzyme regulates the entrance of glucose into the pentose phosphate pathway (PPP). Besides, throughout this route, glucose regulates the transcription of some lipogenic genes. Compared with in vitro produced male embryos, and due to a delaying in X-chromosome inactivation as a consequence of in vitro culture conditions, some early female embryos show two-fold increase in this enzyme (G6PD) and consequently in PPP. It is postulated therefore that this kind of failures in genetic dosage compensation, and in a dependent manner of glucose levels, would generates a sexual dimorphism in lipid metabolic phenotype, at the level of transcription of genes associated to rate limiting enzymes of the synthesis of lipids such as Acetyl-CoA Carboxylase-Alpha (ACACA) and Fatty Acid Synthase (FASN). This would lead to a higher cytoplasmic accumulation of lipid droplets in female embryos with effects on their general metabolism, transcriptional activity of some down stream genes and on their cryotolerance.
ABSTRACT
El objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugación realizada en el proceso de lavado y selección. Los espermatozoides fueron sometidos a diferentes tiempos de centrifugación (10, 30 y 45 min); se utilizó un control negativo con espermatozoides no centrifugados y un control positivo con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con peroxido de hidrógeno (H2O2) (200 μM). Para evaluar la integridad de la membrana se utilizó la prueba hipoosmótica (HOST) y para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el ensayo cometa: El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Fisher. La centrifugación durante 10, 30 y 45 min, presentó un efecto estadísticamente significativo sobre el daño en el ADN, respecto de los espermatozoides no centrifugados (p<0.05). Además, se observó diferencia estadística significa (p<0.05) entre los espermatozoides centrifugados a diferentes tiempos con respecto al control positivo realizado con H2O2 (200 μM). La comparación de medias no indicó diferencia estadística significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min (p>0.05) en la reacción positiva a la prueba HOST, lo cual sí sucedió (p<0.05) al comparar los no centrifugados y los centrifugados por 45 min. El control positivo realizado con H2O2 presentó diferencia significativa (p<0.05) con el resto de los tratamientos. En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides durante 10, 30 ó 45 min a 700 x g para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática.
O objetivo de este estudo foi determinar se a integridade da membrana plasmática e o DNA dos espermatozóides podem ser afetados pela centrifugação realizada no processo de lavado e seleção. Os espermatozóides foram submetidos a diferentes tempos de centrifugação (10, 30 e 45 min); foi utilizado um controle negativo com espermatozóides não centrifugados e um controle positivo com espermatozóides submetidos a estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio (H2O2) (200 μM). Para avaliar a integridade da membrana foi utilizado o teste hipoosmótica (HOST) e para avaliar a fragmentação do DNA Fo utilizado o ensaio cometa: A análise estatística se realizou mediante o teste de Fisher. A centrifugação durante 10, 30 e 45 min, apresentou um efeito estatisticamente significativo sobre o dano no DNA, em relação aos espermatozóides não centrifugados (p<0.05). Além disto, observou-se diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os espermatozóides centrifugados a diferentes tempos em relação ao controle positivo realizado com H2O2 (200 μM). A comparação de medias não detectou diferença estatisticamente significativa entre os espermatozóides não centrifugados e os centrifugados por um período de 10 e 30 min (p>0.05) na reação positiva à prova HOST, o qual ocorreu ao comparar os não centrifugados e os centrifugados por 45 min (p<0,05). O controle positivo realizado com H2O2 apresentou diferença significativa (p<0.05) quando comparado contra os outros tratamentos. Em conclusão, os resultados do presente trabalho sugerem que a centrifugação dos espermatozóides durante 10, 30 ou 45 min a 700 x g para realização do gradiente diferencial de percoll, têm um efeito deletério sobre o DNA dos espermatozóides bovinos e que a centrifugação por 45 min além de causar dano no DNA produz perda da integridade da membrana plasmática.
The aim of this study was to evaluate the effects of different times of centrifugation on plasma membrane integrity and DNA of bovine sperm cells, by means of the hyposmotic test (HOST) and the comet assay, respectively. The sperm cells were centrifuged at 700 x g for 10, 30 or 45 min. No-centrifuged thawed semen served as negative control whereas hydrogen peroxide (H2O2) (200 mM) treated sperm cells were used as a positive control. The results indicate that while the integrity of the plasma membrane was not affected by centrifugation, bovine sperm DNA was damaged independently of centrifugation times. Significant differences between negative control and treatments were found (p<0.05) and in the same way, between treatments and positive control, where the damage for oxidative stress was greater. These results indicate that centrifugation could be detrimental for in vitro bovine embryo production. Additionally, some grade of DNA fragmentation in not centrifuged sperm cells (negative control) was registered, suggesting that DNA of bovine sperm cells could be affected by other factors, probably freezing procedure.